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选择合适的大肠杆菌菌株进行转化

在大肠杆菌(E.coli)等微生物中,克隆、纯化和表达转基因遗传物质是例行公事。这种分子生物学的累赘的亲戚通常生活在人类的肠道轨道上。科学家们在世界各地使用的大肠杆菌(K-12)是在1922.1年从一位白喉病人的粪便中分离出来的。然而,K-12菌株在很大程度上被认为对人类无致病性。

大肠杆菌已经成为一个模型系统,因为它很容易和快速地在规定的介质中生长。在对数生长阶段,这些虫子每隔20到30分钟就会分裂一次!最重要的是,大肠杆菌吸收外来DNA质粒的能力(转化能力)以及制造不同基因突变体的易用性最终使其成为“分子生物学家工具箱”中不可或缺的一部分。

正如我所提到的,E有很多不同的菌株。你可以根据你想做的实验类型来选择大肠杆菌。今天,我将谈论E的生物学的不同方面。这将为选择合适的大肠杆菌菌株进行转化提供重要的参数。

大肠杆菌中常见的遗传突变体

首先你要知道的是你将要使用的大肠杆菌的基因信息。各种工程菌株存在,携带特定的突变,以适应您的实验需要。

在最基本的层面上,我们在实验室中使用的大多数大肠杆菌都含有限制其在野外生长的突变。一个常见的突变可能是在代谢室。例如,如果该菌株有一个leuB突变,您将不得不向培养基中添加亮氨酸才能使其传播。

有些菌株携带生育因子(F+)。这意味着它们含有一个额外的体表质粒,将其遗传物质传递给F-细菌。基于向量的丝状噬菌体感染需要F+菌株,因为它们的表面含有菌毛

另一方面,某些常见的突变如tonA赋予菌株抵抗T1和T5噬菌体感染的能力。这可以大大减少在图书馆建设过程中的遗传污染物

重要的大肠杆菌机械

甲基化

大肠杆菌中的限制系统与人类的免疫系统类似。顾名思义,限制系统通过破坏外来dna来限制它们的传播。大肠杆菌基因组中的某些DNA位点被甲基化,这意味着一个甲基被添加到一个特定的碱基上。细胞分裂时,DNA甲基化模式被大肠杆菌子细胞遗传。由于外来DNA不经历这个过程,并且保持未甲基化,所以限制系统有一个识别外来DNA的基础。因此,执行甲基化的酶、大肠杆菌的甲基酶和切掉未甲基化DNA的内核酶在机体的防御中起着重要的作用。

大肠杆菌k - 12甲基化酶系统通常包含三种不同类型的甲基化酶:大坝,Dcm,和生态K.1甲基化酶转移甲基腺嘌呤、胞嘧啶基地内识别主题或站点的基因组中,从而有效地标记本机大肠杆菌基因组作为“自我”。大肠杆菌的内核酶可以识别特定的DNA识别位点,并在这些位点中分离DNA。可以防止内切酶系统分裂甲基化限制性位点。因此,缺乏这种甲基化作用的外来DNA可以被本地的内眦裂。

由于某些核酸内切酶无法消化甲基化DNA,如果你想制备在甲基化位点被核酸内切酶切割的质粒,那就选择一个dam和dcm缺乏的大肠杆菌菌株!

复合

重组对细菌来说很重要,因为它能让细菌“重新洗牌”自己的遗传物质,并提高存活的机会。然而,一个分子生物学家最可怕的噩梦是意识到他最喜欢的质粒/蛋白质序列由于自然选择而被打乱了!如果克隆序列包含直接重复序列,或者正在构建一个遗传库,那么重组就是一个大问题。

因此,大多数常见的实验室菌株都含有基因突变,在重组通路中编码蛋白质。重组途径主要有三种:recBCD、recE和recF。所有这些路径都属于主开关recA。这就是为什么你会发现很多菌株是recA-的原因。recA基因突变可以降低重组率10000倍!然而,这种特殊的突变使这种细菌非常残废,难以生长。

大肠杆菌的重要修饰

蓝色/白色选择

E的一个重要修改。能够对菌落进行视觉筛选的大肠杆菌来自对紫胶操纵子的研究。这种细菌操纵子含有三种协同工作的蛋白质,可以将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。紫胶操纵子由“抑制因子”控制,它与乳糖结合。因此,只有在乳糖存在的情况下,操作数才会被激活,这使得任何分子生物学家都可以严格控制乳糖操作数内基因的表达。

其中最关键的是lacZ基因,该基因编码-半乳糖苷酶,一种渗透酶和乙酰化酶。-半乳糖苷酶蛋白的5 '(阿尔法片段)或3 ' (w片段)的突变使其失去活性。等等,如果你把这两个碎片分开,然后把它们放在一起呢?

宾果!你会得到正常的-半乳糖苷酶活性。

这被称为字母互补,形成了蓝白选择的基础。蓝/白选择质粒包含从大肠杆菌基因组中删除的阿尔法片段基因。然后在质粒中-片段基因中间插入一个多克隆位点(MCS)。因此,当你将感兴趣的基因插入MCS中时,阿尔法互补就会被抑制,半乳糖苷酶不能将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖,菌落就会变成白色。如果你的基因不在-片段基因中,那么-互补就会发生,菌落就会是蓝色的。您可以选择白色的殖民地和屏幕为您的插入。这种互补试验是筛选插入基因的好方法。

IPTG诱导蛋白表达

同样地,lac操纵子可以被设计来调节基因和蛋白质的表达。例如,pET表达系统包含一个lacI基因,该基因编码lac抑制因子和一个T7启动子,T7 RNA聚合酶特异性启动子。pET质粒是一种很好的蛋白表达系统,E是它的重要补充。缺乏蛋白酶的大肠杆菌菌株。

结论

我希望这些关于大肠杆菌菌株的背景能帮助你在实验中做出更好的选择。你也可以得到更多的欣赏这个小虫子能做什么和分子生物学的潜力!

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