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CARM1通过MED12调控RNA结合

精氨酸甲基化是一种常见的翻译后修饰,约0.5%精氨酸残基在MEFs中被甲基化(Dhar et al, 2013)。这一修饰涉及了许多生物过程,如转录、剪接、信号转导和DNA修复(Yang & Bedford, 2013)。精氨酸甲基化是由一群九催化蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMTs),可以分为三种类型:I型(PRMT1,2、3、4、6、8)酶生成ω-NG NG-asymmetric dimethylarginine(ADMA)II型(PRMT5和9)酶生成ω-NG,N 'G-symmetric dimethylarginine(SDMA)和类型III(PRMT7)酶形式ω-NG-monomethyl精氨酸残基在哺乳动物细胞(贝德福德&克拉克,2009;杨等人,2015)。

Coactivator-associated arginine methyltransferase (CARM1),也被称为PRMT4,首次在酵母夹层结合蛋白双杂交筛选出(Chen et al, 1999)。转录启动子中CARM1的募集导致p160辅激活因子家族(SRC-1/NCOA1, SRC-2/GRIP1/NCOA2和SRC-3/NCOA3)、组蛋白乙酰转移酶(p300/ creb结合蛋白[CBP])和组蛋白H3 (H3R17me2a和H3R26me2a)的甲基化(Chen等,1999;Lee等人,2005;冯等人,2006)。这些甲基化事件增强了基因激活;因此,CARM1被认为是核受体介导转录的次要辅激活因子。此外,CARM1也显示coactivate NF-κB(Covic等,2005)。此外,H3R17me2a染色质免疫共沉淀(ChIP)研究显示,包括pS2/TFF1、E2F1、CCNE1、aP2/FABP4、Oct4、Sox2、CITED2和Scn3b等基因启动子的水平升高(Bauer et al, 2002;El Messaoudi等人,2006;Frietze等人,2008;Kleinschmidt等人,2008;Yadav等人,2008;Wu等人,2009;Carascossa等人,2010;O'Brien等人,2010年)。CARM1是一种非常普通的转录共激活因子。小鼠基因消融研究揭示CARM1对于生存至关重要(Yadav et al ., 2003)。虽然CARM1 KO胚胎体积较小,但它们在外表发育上是正常的。这些零胚确实表现出一些细胞分化缺陷,如t细胞发育中的部分阻滞(Kim et al, 2004)和肺肺泡细胞和脂肪细胞分化不当(O’brien et al, 2010) (Yadav et al, 2008)。酶死亡CARM1敲入小鼠的表型与空白小鼠相同,表明CARM1的大部分体内功能都需要酶活性(Kim et al, 2010)。因此,对CARM1甲基化蛋白质谱的详细了解对于深入了解这种酶在不同环境下如何调节转录是至关重要的。

我们实验室和其他人的底物筛选工作揭示了由CARM1甲基化的两大类蛋白质:rna结合蛋白和转录调节机制的组成部分。在高密度蛋白大阵列上进行的大规模酶反应导致了CARM1底物的发现,例如聚a结合蛋白(PABP1) (Lee & Bedford, 2002)。采用小池筛选方法,剪接因子(SmB、SAP49和U1C)和转录伸长因子(CA150)被鉴定为CARM1底物(Cheng et al ., 2007)。rna结合蛋白HuR和HuD (Li等,2002;Fujiwara et al, 2006)被候选方法识别,其他种类的蛋白质,包括转录因子(Sox2, Sox9和Pax7) (Ito et al, 2009;赵等人,2011;包括SRCs和p300/CBP在内的转录共激活子(Chen等,2000;Lee等人,2005;Feng等人,2006)和RNA聚合酶II c -末端结构域(Sims等人,2011)。大多数PRMTs (PRMT1, 3,5,6,和8)识别和甲基化一种甘氨酸和精氨酸丰富(GAR)基序(Yang & Bedford, 2013),这促进了精氨酸甲基特异性抗体的开发,可用于识别和帮助鉴定这类PRMTs的底物。第一个甲基- gar motif抗体(ADMA和SDMA)由Stephane Richard实验室开发,用于免疫沉淀(IP)-耦合质谱(MS)实验,以识别新的甲基化蛋白(Boisvert et al ., 2003)。这种方法最近得到了扩展,开发了额外的甲基特异性抗体,这些抗体可以识别砷样单甲基精氨酸和ADMA基序,这些抗体使用冗余的肽库和固定的甲精氨酸残基作为抗原(Guo et al, 2014)。另一种(不依赖抗体的)鉴定甲基化蛋白的方法是对“细胞培养中氨基酸标记的稳定同位素”(SILAC)技术进行修饰,称为重甲基SILAC (Ong et al, 2004)。重甲基硅烷利用了甲硫氨酸被细胞吸收并转化为唯一的生物甲基供体AdoMet的事实。因此,如果在这些实验中使用[13CD3]蛋氨酸,体内甲基化蛋白就会与重甲基基团结合。利用该方法,结合甲精氨酸富集技术,鉴定出大量PRMT底物,包括中介复合物亚基12 (MED12) (Uhlmann et al ., 2012;Geoghegan等人,2015)。随后,我们使用ADMA抗体鉴定MED12为高度甲基化蛋白(Guo et al, 2014), Wei Xu的团队进一步鉴定MED12为CARM1底物(Wang et al, 2015;Shishkova等人,2017)。最近,精氨酸去甲基化酶JMJD6与MED12相互作用,可能抵消CARM1的活性(Gao等,2018)。

重要的是,CARM1具有独特的底物特异性,而且它不会甲基化GAR motifs (Lee & Bedford, 2002;郑等人,2007)。因此,为了快速鉴定新的CARM1底物,我们开发了CARM1-motif抗体筛选策略来丰富CARM1-甲基化蛋白。这一方法是基于H3R17me2a抗体(Millipore公司)在组蛋白H3上的不对称的二甲基精氨酸17标记上培育出来的,当用于WT和CARM1 KO胚胎的Western blotting蛋白提取时,它会与许多CARM1底物发生交叉反应(Yadav et al ., 2003;程等人,2012)。这些蛋白进一步证实为CARM1底物(Cheng et al ., 2007)。因此,我们推测CARM1-methylated motifs具有相当松散的共识序列,可以用来提高pan抗体,这些抗体可能识别未知的CARM1底物。用一种CARM1甲基化基序作为抗原,我们证明可以开发出CARM1基序抗体。此外,我们还将KMT2D、g -蛋白通路抑制因子2 (GPS2)和SLM2作为新的CARM1底物,以及一些先前鉴定的CARM1底物,如MED12。

在这里,我们证实了MED12在R1899时以非冗余的方式被CARM1甲基化,并证明MED12的精氨酸甲基化正调控着雌激素调控基因的转录。为了确定这种效应的机理基础,我们发现MED12-R1899me2a标记为都铎带效应分子TDRD3的对接位点。TDRD3是一种已知的转录辅激活因子,通过向染色质招募拓扑异构酶(TOP3B)活性来发挥作用(Yang et al ., 2010, 2014)。重要的是,我们提供的证据表明(1)CARM1活性(2)MED12上的R1899甲基化位点(2)和(3)招募TDRD3都是MED12结合激活长链非编码rna (ncRNAs)所必需的。

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