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核酸结合蛋白的2C提取

从DNA和RNA形式的遗传信息的储存和传递,到通过沉默机制和像核糖酶这样的效应功能来调控基因表达,核酸在细胞生命中起着中心作用。几十年来,人们一直致力于开发简单的方法,从多种生物来源中分离出纯核酸。简单核酸分离方案的实施的关键发现是超热带盐的强蛋白质变性特性(Gordon, 1972;Chirgwin等人,1979),核酸和蛋白质在水相和有机相中的微分分配作为核酸纯化的单一步骤方法(Chomczynski和Sacchi, 1987),以及发现核酸与硅基基质的强选择性结合(Boom等人,1990;古永锵等人,1998)。这些创新极大地简化了核酸的分离,并导致了广泛使用的协议和商业套件的发展。

从生物学角度看,核酸的细胞作用只能在蛋白质的作用下才能被理解,蛋白质在核酸的存在过程中起着辅助和伴随作用(Muller-McNicoll & Neugebauer, 2013;Rafiee等人,2016)。为了研究DNA和rna -蛋白复合物的组成和生物学功能,已经开发了不同的分离方法。虽然纯化在自然条件下能更好地保持生物复合物的生理状态,但它通常受到其他细胞成分的严重污染(Gagliardi & Matarazzo, 2016)。另外,交联可以用来稳定核酸-蛋白质的相互作用,允许在净化过程中使用更严格的条件来减少污染物的水平。通过这种方式,研究dna -蛋白相互作用的几种方法涉及到使用交联剂稳定dna -蛋白复合物,然后是染色质碎片和感兴趣的蛋白质的免疫沉淀,这是目前可用的不同的染色质免疫沉淀方案(Orlando, 2000;公园,2009;Rafiee等人,2016)。

RNA-蛋白复合物(RNPs)的研究面临着来自RNA不稳定性和细胞内更动态的RNA基过程的技术挑战(Muller-McNicoll & Neugebauer, 2013;Dassi,2017)。紫外光(Wagenmakers et al, 1980)是稳定rna -蛋白在体内相互作用的首选交联方法之一,它能在“零距离”促进rna和直接结合蛋白之间形成共价键(Hockensmith et al, 1986;Brimacombe等人,1988年)。基于紫外光交联的几种研究RNPs的技术为我们拓展RNA代谢的知识铺平了道路(Hentze et al ., 2018)。这种方案的夹层捕获和适应的发展使不同生物体内rna结合蛋白(RBPs)的综合列表得以生成,并促进了不同条件下的比较研究(Baltz等人,2012;Castello等人,2012,2013;Beckmann等,2015;Hentze等人,2018年)。直接参与RNA结合的肽域的识别得益于RBDmap的开发(Castello et al., 2016, 2017)。最后,通过一系列交叉链接和基于免疫沉淀的协议(Van Nostrand et al, 2016;Lee & Ule, 2018年)。

在这里,我们报道了一种用于纯化核酸的硅基固相萃取技术,可以用于捕获与核酸或完全核酸结合蛋白体交联的单个蛋白质。我们将这种简单而健壮的方法称为“复杂捕获”或2C。2C方法大大简化了核酸蛋白复合物的分离,不需要使用放射性来检测特定的核酸结合蛋白,简化了下游应用。

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