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如何制造自己的化学活性细胞

我曾经有过一段可怕的经历,我无法进行化验,因为我的转化能力大肠杆菌(E.coli)的商业库存用完了。从那一天起,我学会了在实验室里制造自己的化学细胞。

我建议每个人都有自己的转换能力E。大肠杆菌库存,以及其他实验室活动。首先,每个分子生物学家都应该学习如何做到这一点。第二,非常简单。第三,它将节省你的钱,防止紧急情况。

今天,我将向你们展示如何自制一种具有化学活性的大肠杆菌。他是分子生物学实验室的主力。

你需要的东西

在RB(浓汤)中培养的大肠杆菌的新鲜过夜培养

无菌离心管(即,为贝克曼JA-17转子)

用于读取大肠杆菌密度的光谱仪

冰寒的CaCl2, 30毫米

5毫升微离心管

细胞制备

你怎么做的?大肠杆菌乐于接受外来质粒?你看,这些小虫子通常不会无缘无故地吞食任何外来物质(包括质粒)。关键是破坏(激活)E的细胞膜。大肠杆菌,这样它就可以准备好接受质粒。Chemically-competent E。大肠杆菌基本上是指细菌经过化学预处理后,在需要的情况下(你的实验),细菌就可以利用质粒。

简而言之,你需要增加你的E批。大肠杆菌从一个小体积和扩大他们。然后,收集E。当大肠杆菌活跃分裂时(对数生长)。因为人口在对数增长期间是同步的,E。大肠杆菌将为转化能力做最好的准备。这实际上是非常关键的一步。另外,在制作一批化学活性E时。大肠杆菌,不要在培养基中添加任何抗生素。你没有扩增质粒,这就得到了实验室E。大肠杆菌是抗生素耐药性。生长后,用一系列冷盐缓冲液处理小虫,使细胞膜半透质DNA。

这里有一个关于如何准备你自己的化学能力E的简单方案。杆菌的股票。

如何制造具有化学活性的细胞

在摇壶上培养大肠杆菌过夜(技巧1:不使用抗生素)

取E的应变。你希望从甘油或者新鲜的琼脂培养基中制造出具有化学活性的大肠杆菌并将其接种到一个装有大约50毫升RB的烧瓶中。让它一夜之间生长。正如我所说,这一步不需要抗生素!

他们的亚文化

第二天,取少量的E过夜。杆菌文化(~ 500μL)和他们的亚文化到另一个包含50毫升的RB孵化瓶。

生长到合适的光密度(OD)

每2到3小时检查一次OD600,直到它达到期望的值。每个实验室都有不同的OD600值,范围从0.3到0.5。E。在这个OD600范围内的大肠杆菌仍然处于对数生长期。一旦培养达到超出此范围的外径,细菌培养将处于固定相。

在无菌JA-17试管中以8000 rpm离心5分钟

在这一步之后,把一切都放在冰上

重新悬浮在5ml的冰镇CaCl2中

重新分配到预冷的1.5 mL超离心机管

在微离心机和小球中旋转

500年Re-suspendµL冰冷的氯化钙

整除50µL无菌micro-centrifuge管

存储冰箱管在-80°C

通过使用含有阳性选择标记的质粒进行转化,检查化学反应能力细胞的转化效率

我非常喜欢实验室试剂的DIY运动。我们很幸运能在这个时代从事科学研究,因为有这么多“工具箱”可供选择。然而,学习如何自己制备大量的试剂总是好的。在紧急情况下,这些秘密的“个人股票”会给你带来巨大的红利。更不用说,在财政紧缩时期,DIY总是一个对预算有利的选择。你也可以尝试制作自己的电感应电池。

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