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从全血DNA分离中获得最大产量的8个最佳方法

当你从全血中提取基因组DNA时,低产量或低质量的DNA会导致很多问题。无论你的下游应用是什么——qpcr、下一代测序、桑格测序等等——你都需要高质量的DNA。我们已经做了一步一步的指导,以帮助你获得尽可能高的DNA产量和质量,并让你得到一些伟大的结果。

选择(或知道)最佳的样品存储条件

抗凝剂

抗凝剂有多种选择。从DNA产量和质量的角度来看,EDTA是最好的选择,其次是柠檬酸钠。

肝素应该尽量避免,因为它会干扰DNA最终产物的纯度。这是因为在纯化过程中很难从DNA样本中去除,并且抑制了下游的PCR分析。另一方面,EDTA在标准提纯过程中很容易被去除。

有证据表明,EDTA作为更好的抗凝血剂的选择略优于柠檬酸钠,这来自于一篇有趣的论文,该论文跟踪了样品在室温(RT)下保存在EDTA、柠檬酸钠和肝素中对DNA提取率的影响

结果表明,样品在RT下保存12小时后,DNA产率有明显差异。edta保存样本的DNA产量未受影响,而柠檬酸钠或肝素保存的样本DNA产量明显下降。

虽然我们不建议你将样本储存在RT实验室,但这项研究表明EDTA在DNA样本上增加了额外的保护层。这种额外的保护使EDTA超过柠檬酸钠的优先顺序。

光照与温度

阳光暴露你的样品和/或温度高于4ºC应该最小化保存的DNA样本。紫外光通过在DNA中形成胸腺嘧啶二聚体而损害DNA。随着温度的升高,破坏DNA的化学反应也在增加,比如氧化和酸水解。

所以,你冷冻样品的速度越快越好。

如果在三日内将使用一个示例,冷藏后尽快在4ºC样品。一项研究表明,当从采血到冷藏的时间减少时,DNA产量显著增加

另一方面,如果样品不会3天内处理,冻结并将其存储在-80ºC。根据Caboux等人2012.2的观点,理想情况下,这应该发生在抽取样本后两小时内,以避免对基因组DNA提取的产量产生任何影响

溶血

最后,一旦样品在你的手中安全储存,避免溶解样品中的红细胞(溶血)。如果需要的话,你可以通过混合血液样本来避免溶血,然后通过温和的倒置来避免溶血。一项针对5万多份DNA样本的特别研究发现,溶血程度与DNA产量成反比

所以,温柔地对待你的样品!

细胞计数

最好的做法是检查正在处理的样品的细胞计数,要么用血球计,要么用自动细胞计数器。

当然,开始时细胞数量过少会导致低产量。但是使用更多的细胞只能在一定程度上起作用。如果开始使用的细胞数量超过化学反应所能处理的数量,将导致低产量和增加不完全裂解的可能性,以及蛋白质和其他污染物的携带,这将干扰下游应用。

检查您选择的DNA分离方法的手册,以确定最佳的细胞计数,或确定理想的浓度与稀释系列经验。

如果你发现你的细胞计数过高,将样本分成两个aliquots,并执行两个单独的提取。

选择最好的全血基因组DNA提取方法

有了适当的存储和相关的样本信息,下一步是确定使用哪种提取协议来获得最佳的DNA产量。

最常见的选择是酚-氯仿提取、磁珠分离和沉淀化学(或“盐析”)。产生最高DNA产量和纯度的方法是沉淀化学。

苯酚和氯仿是这些方法中最古老的一种,但使用的是需要非常小心处理的刺激性化学物质。除了是一个安全问题,任何苯酚或氯仿被携带到提取的最后可能会对下游应用产生负面影响。因此,就像肝素一样,这种DNA分离的方法应该尽可能避免。

使用磁珠提取DNA是一种毒性较小的方法,但磁珠有可能被携带,导致下游过程的污染和抑制。同样,就像酚-氯仿方法一样,如果可能的话,你要避免这种情况,因为珠子的结转会影响到你使用它进行PCR和其他下游应用的能力。

沉淀化学或“盐析法”是一种流行的DNA提取方法,因为它的结果是很少或没有污染和一致的产量。这种方法有各种各样的工具包。Puregene方法依次溶解红细胞和白细胞,用RNase处理溶解的样品,然后沉淀蛋白质和其他污染物。相比之下,新的FlexiGene方法一步溶解整个血液样本,通过收集白细胞细胞核小球立即去除RNA污染,然后用含有蛋白酶的缓冲液和一种混乱的盐来去除剩余的污染物。在这两种方法中,DNA都是通过酒精沉淀恢复的。

额外的建议,以提高你的DNA产量从血液样本

提高血液样本DNA产量的最大机会在于样本的储存和处理。尽管如此,这里还有一些额外的技巧可以帮助你提高产量:

考虑自动化。从全血中自动提取DNA不仅在每个样本之间更加一致,而且还消除了人为错误。2-4自动提取DNA也会节省你的时间,特别是当你有大量的样本要处理的时候。你可以建立自动化系统,然后再回到高质量,纯DNA。

照顾好你的酶。这可能是一个新手的建议,但有时那些是最好的。为了防止由于过度的冻融循环而导致蛋白酶的降解,使用含有酶的缓冲液。如果这个方法不奏效,可以考虑重新尝试一种新的酶作为第一步。

小心你的DNA颗粒。大多数DNA提取过程在酒精沉淀后以颗粒干燥结束。这一步可以消除任何过量的酒精,但要注意不要过量。resuspending DNA如果你有困难,试着加热DNA颗粒与各自的补液缓冲55ºC大约5分钟。

总而言之,从全血中提取DNA并不是很复杂,但却可能存在大量错误空间,对最终产品的产量和纯度产生负面影响。这些提示将帮助您导航过程,以避免大多数陷阱,并给您高产量的无污染DNA。

参考文献

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