生物科学门户网站
BIO1000.COM

从FFPE组织中提取DNA进行下一代测序

下一代测序(NGS)提供的快速基因组分析是临床遗传学、微生物分析和诊断肿瘤学的个性化医学方法的理想选择。许多标准的临床样本被保存为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织,这为NGS分析提供了障碍。

FFPE组织保存具有保存样本完整的优点,可用于数十年的组织学检查。然而,这是有代价的——化学交联会降低下游分析所需的DNA质量。适用于NGS分析的FFPE-DNA的提取需要能够有效克服福尔马林固定引起的核酸交联,而不会造成DNA进一步损伤的条件。除此之外,提取的DNA需要控制剪切成可管理的片段,以便NGS文库的准备。

DNA提取和剪切在一个无缝协议

最好的NGS实验从一个健壮的FFPE-DNA提取平台开始,并将提取的DNA剪切成清晰的片段。直到最近,DNA提取和剪切作为单独的和不同的协议被执行。这导致了材料的损失和实验之间缺乏连续性或标准化。一定有更好的办法。进入结合,无缝DNA extraction-shearing平台,FFPE DNA提取设备和Bioruptor Diagenode®。

这种联合提取-剪切协议的优点是引人注目的:

温和的DNA提取——FFPE组织DNA提取的一个问题是,脱亲和脱水的苛刻条件会对DNA造成额外的损害。这个问题是解决DNA提取工具。石蜡的去除和再水化过程结合成一个步骤,以避免使用苛刻的溶剂或过高的温度。这些温和的治疗方法可以消除由福尔马林固定产生的交联,同时保持DNA完整性。

DNA剪切纳入DNA的DNA提取协议——剪成一个一致的片段大小的范围是一个重要的先决条件成功总会在图书馆准备。通过将试剂盒和剪切仪耦合到一个协议中,DNA提取和剪切过程在实验之间是一致的,并经过精心优化,最终得到高产的、ngs质量的DNA片段,用于可靠的下游分析。

高通量-一个繁忙的实验室可能有许多样品在队列中FFPE-DNA提取。该协议允许同时处理多个样本,以获得最大的效率。例如,Bioruptor®可以剪切12到16 DNA样本,根据模型。

有效的DNA剪切和质量控制

这种无缝协议只需要几个步骤就可以完成,对材料的操作也非常少。

在含有10的微管中对DNA进行脱亲和作用?在FFPE提取缓冲液中孵育M厚组织切片。涡和用使用Bioruptor®,那么将上层清液移到一个新管。用蛋白酶K处理DNA,用交联去除缓冲液孵育,去除污染蛋白。用柱过滤法分离DNA,完成DNA提取程序。DNA片段,使用一个标准的Bioruptor®协议来获得你想要的片段大小进行DNA测序。记住,NGS所需的DNA片段长度取决于商业平台。

在成功提取和剪切后,在NGS文库准备之前,评估DNA的质量、产量和破碎状态。

有几种方法可以做到这一点:

琼脂糖凝胶电泳分离剪切DNA。这是一种低技术含量的DNA完整性可视化方法。离散条带模式表明DNA片段一致,而涂片表明DNA降解。

使用微流体毛细管电泳的DNA可视化破碎模式和确认所需的DNA片段大小。DNA定径和定量测量是基于与内部标准的比较。

进行终点PCR,以评估DNA的产量和质量。

一旦确定了DNA的大小和片段,就可以为NGS文库的准备工作做好准备。

通过使用旧的样品来克服传统的障碍

传统方法会导致FFPE样品中的DNA质量较差。这是因为在福尔马林的过度固定导致广泛的交联,这是很难逆转的。此外,较老的FFPE样本,尽管在组织学上得到了保存,但与新鲜或冷冻组织相比,其释放的DNA分子量更低。

然而,DNA提取-剪切联合平台,如FFPE DNA提取试剂盒与Bioruptor可以提供一致的,高产量的片段DNA。随着下一代革命从实验室走向临床,这将继续改变DNA样品的制备。你可以在这里找到完整的DNA提取和剪切协议。有关ffpe样本、剪切和NGS的DNA提取的更多信息,请参阅下面列出的参考资料。

额外的资源:

Diagenode。FFPE DNA提取协议使用Bioruptor®。

Lakha W,等(2016)利用成岩剪切系统和片段分析仪进行DNA片段化和质量控制分析。自然方法。13(10)。

如何确保你的NGS结果是稳健的。

郑重声明:本文版权归原作者所有,转载文章仅为传播更多信息之目的,如作者信息标记有误,请第一时间联系我们修改或删除,多谢。