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让CRISPR试剂进入细胞的四种方法

你需要测试在你的系统中突变一个基因的效果吗?然后,CRISPR基因组编辑是一条出路。你的第一步是确定好的目标序列。然后,你必须得到CRISPR的两个组成部分:Cas9核酸酶和“指南”RNA (gRNA)。尽管您已经在网上了解了该技术,但是有很多方法可以将这些组件放入细胞中,而且很难知道选择哪一个。

在决定如何将CRISPR-Cas9引入您的细胞时,有几个因素需要考虑。这里列出了一些可能的方法,以及在选择它们时应该考虑哪些方法:

CRISPR的质粒/表达载体解释!

您将需要一个包含编码Cas9的序列的质粒,以及您所选择的gRNA序列的相同或另一个质粒。Addgene等人已经使这种序列广泛可用,包括具有多种启动子的版本——既有组成的,也有可诱导的。您可能不得不将感兴趣的gRNA克隆到一个向量中,除非您足够幸运,其他人已经这样做了。Addgene列出并分发了许多经过实验验证的gRNAs。

这些向量提供了很大的灵活性——您想要Cas9稳定表达还是瞬态表达更好?你想把Cas9和gRNA表示在同一个向量里还是不同的向量里?注意,可以为Cas9和gRNA使用单独的载体,这允许您灵活地将Cas9与不同的gRNA组合在一起。哪些启动子在你的细胞类型中起作用?您希望使用选择标记或简单标记标记成功转染的细胞吗?记住,这并不意味着它们已经被成功编辑了!虽然使用表达载体提供了很大的灵活性,但效率高度依赖于您感兴趣的细胞。

CRISPR病毒载体

另一个选择是使用病毒载体将编码Cas9和gRNA的DNA引入细胞。慢病毒是一个流行的选择,但其他逆转录病毒(如MSCV)可能使用取决于细胞类型。

与使用质粒一样,这种方法通常需要将gRNA序列克隆到一个向量中。效率在一定程度上取决于你在选择的细胞中获得的转导效率。您可以选择引入一个选择标记或其他标记来识别被转导的细胞,并能够为Cas9和gRNA使用单独的载体。与稳定的转染一样,病毒整合可能对你的细胞有负面影响,所以如果你选择其中一种方法,请记住这一点。

如果您计划频繁地在项目或实验室中使用一个向量,那么克隆一个向量可能是值得的。

Cas9 mRNA和gRNA

如果你不想花时间用合适的启动子将gRNA序列克隆到载体中,或者你的细胞很难转化和转染,那么你可以在体外转录cas9 mRNA和你感兴趣的gRNA。如果成本不是问题,你甚至可以付钱让别人为你制作,从而节省你更多的时间!然后,通过电穿孔或微注射将它们引入你的细胞中。您将得到Cas9和gRNA的瞬时表达,这可能更可取,尽管您可能会失去一些效率。这种方法的另一个缺点是,您无法选择同时表达Cas9和gRNA的单元格。同样,对于您的系统来说,这可能是问题,也可能不是问题。

Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物

在体外转录Cas9蛋白和gRNA核糖核糖蛋白复合物无需克隆,而且比等待Cas9翻译所需的时间更短。要使用这种方法,你要在体外转录你感兴趣的gRNA并与商业生产的Cas9蛋白复合物。这只需将两种成分混合在一起,在室温下保存15分钟即可。然后通过电穿孔或阳离子脂质将这种复合物引入你的细胞。请记住,与mRNA/gRNA方法一样,如果使用Cass9-gRNA核糖核蛋白复合物,您将无法获得任何标记或选择。

总的来说,在选择将CRISPR cas9基因编辑组件引入细胞的系统时,有一些重要的考虑因素。您需要考虑获得/制造试剂的时间,瞬态或稳定表达,是否需要选择或标记,效率(针对您的细胞类型!),以及对细胞生存能力的影响。您可能已经知道哪种转染或转导方法在您使用的细胞中工作得很好。如果没有,你应该可以找到一些关于这个主题的文献。同样值得在网上快速搜索CRISPR和您感兴趣的细胞类型,以比较不同实验室报告的不同方法的效率。CRISPR基因组编辑是一项强大的技术,但在针对你的细胞时,你不需要重新发明轮子!

如何让CRISPR组件进入细胞?在评论区与我们分享你的经验!

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