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如何选择从全血中提取DNA的方法

在过去的几十年里,PCR、下一代测序和微阵列技术将基于血液的研究提升到了一个新的水平。现代基于血液的应用范围从DNA指纹、全基因组测序、血库到液体活检等等。无论如何,从全血中提取纯的、完整的、双链的、高度浓缩的DNA是这一领域成功的必要先决条件。

您选择的全血DNA分离技术不仅影响您的结果,而且影响您的分子生物学工作流程的便利性。和许多其他科学技术一样,选择提取方法本身就是一个挑战!实验室通常有自己喜欢的经过试验和测试的协议。不同的实验方法可能会有不同的设置和用于分离细胞和选择性分离DNA的确切化学物质。然而,几乎所有可用的全血DNA分离方案都涉及这些常见步骤:细胞裂解、去除蛋白质、其他污染物和RNA,以及(最后)DNA恢复。本文将帮助您了解从全血中提取基因组DNA的不同方法。

DNA提取协议-沉淀化学

全血DNA的分离采用沉淀化学,通过高盐浓度和添加酒精(乙醇或异丙醇)将DNA从裂解液中析出。这种方法很容易将DNA从其他生物分子和有机化合物(如脂类和碳水化合物等大分子)中分离出来,这些大分子和有机化合物可能会干扰下游应用。这种方法还可以将DNA从血液中可能存在的任何外源添加的化合物中分离出来(例如药物发现程序中的新化学物质)。我们可以进一步将沉淀化学方法细分为一或两步溶解法。

两步溶菌作用:

在两步裂解方法(用于Puregene包),第一步溶解红细胞使用洗涤剂,如十二烷基硫酸钠(SDS)和特里同™x - 100。然后,第二步确保白细胞溶解,释放细胞核、基因组DNA和RNA(图1a)。核糖核酸酶处理(通常用RNAse A)然后去除污染的rna,把DNA和蛋白质分子留在上清中。

下一步是用浓缩盐去除蛋白质,浓缩盐可以从溶解的细胞中沉淀蛋白质。随着盐和游离水的加入导致阳离子浓度的增加,蛋白质的溶解度降低,导致蛋白质“盐析”。然而,DNA残留在收集的上清液中。

一步裂解:

在一步裂解法(在FlexiGene试剂盒中使用)中,红细胞和白细胞一步裂解;这是通过一种能够溶解两种细胞类型的洗涤剂混合物来实现的。这个裂解步骤从白细胞中释放细胞核和线粒体,这些细胞通过离心收集,留下上清RNA(图1b)。

就像一步(Puregene)方法一样,下一步是清除污染蛋白质。在这里,白细胞细胞核和线粒体被变性缓冲液处理,其中包含一种混乱的盐和一种蛋白酶。这同时变性和消化细胞核和线粒体中的蛋白质,将消化的蛋白质和基因组DNA留在溶液中。

在这两种方法中,DNA都是通过酒精沉淀回收,然后用Tris或Tris- edta缓冲溶液再水化。孤立的DNA是稳定在4°C和-20°C 10 +年。

与传统的两步法相比,一步法有很多优点:

最重要的是,对你的DNA产量,它消除了可能产生的样本损失,在两个步骤的过程中。

不需要更换管子。,对于手工操作,样品混合的风险大大降低)

它节省了你在实验室的时间,因为有更少的步骤,没有过夜孵化或清理步骤。例如,两步沉淀化学法需要48小时才能将DNA溶解。

一步分解法对实验室的预算也很有利。它更便宜,因为它不需要额外的酶,如RNase,或任何额外的设备。

用磁珠提取DNA

磁珠捕获是提取DNA的最新方法。利用磁珠进行全血DNA分离的方法是在磁珠上捕获DNA,磁珠上涂有一层二氧化硅基质,用于结合核酸。

与沉淀化学方法一样,首先必须使用SDS或类似的洗涤剂溶解整个血细胞。下一步是将溶解的细胞和磁珠混合,让DNA与磁珠结合。

在磁场存在下进行几轮清洗,然后将磁珠上捕获的DNA从其他未结合的细胞污染物中分离出来。然后,低盐缓冲液将DNA从珠子中分离出来。

一些研究,包括Carpi等人的评论,表明磁珠是最快的方法。然而,这种速度是有代价的——金钱和DNA的产量和纯度。磁珠法可以使你的DNA产量减少20%。此外,任何磁珠携带污染您的DNA样本和干扰下游应用。最后,这是最昂贵的方法,因为它需要磁捕捉架、板和磁珠。

临别忠告

不管你选择哪种方法,事情都会出错。这里有一些有用的提示,你可以纳入,以确保高质量,高产量的基因组DNA从全血为您的下游应用:

做一个试点实验。在开始使用大量示例的新技术之前,先从小处着手。在投入大量的时间和金钱进行真正的实验之前,你会发现缺陷所在,并能够优化你的程序,使其达到完美。

使用DNA防腐剂。近年来,市场上出现了大量的DNA稳定试剂。这些是液体试剂,你可以在分离后立即加入你的血液样本,以抑制核酸酶活性和潜在的污染微生物。这允许你储存未经处理的血液很长一段时间,而不用担心DNA降解。另一个优点是,您可以一起处理一个实验的所有样本,从而减少变异的来源。一些商业上可用的产品需要在下游应用之前移除稳定剂,所以要注意这一点!

正确测量你的DNA数量。基因组DNA制备过程中存在的污染物、降解的DNA和RNA会影响你的结果。不幸的是,如果依赖于一种量化方法,您可能并不总是能够捕获这些入侵者。因此,明智的做法是将分光光度法和琼脂糖凝胶电泳相结合,在开始耗时和昂贵的下游应用之前,将基因组DNA形象化和量化。

使用在线社区。网上有很多其他科学家提供的帮助,他们可能已经解决了困扰你的问题。ResearchGate、在线协议和LinkedIn群组都值得一试。同样,来自供应商的技术支持也是故障排除和一般建议的另一个优秀资源。

最后……

生物技术、细胞生物学、生物化学和一般生命科学的进步,确实让我们在实验室里无法选择。然而,几乎所有的实验室技术,从结构生物学到分子生物物理学,每种方法都有自己的优点和缺点。这里提供的协议概述和提示将帮助您选择全血DNA提取路径。对于你的研究来说,正确的技术可能是一种能够为你提供最优质的DNA的技术。

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